微藻污水處理技術(shù)以藻細(xì)胞為主體代謝利用污水中的C、N、P等物質(zhì)，該過程增殖的藻細(xì)胞既可用于生物質(zhì)能源生產(chǎn)又可作為工業(yè)原料提取藻蛋白、微生物絮凝劑等，另外藻類光合作用過程對CO2的吸收也被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)大氣碳固定的可行途徑。盡管微藻污水處理技術(shù)自提出已有50多年的歷史，但工藝和理論研究仍十分薄弱，諸如分離采收困難、細(xì)胞密度低等問題極大地限制了該技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。

　　微藻細(xì)胞較小、帶負(fù)電荷、密度接近于水等固有屬性的限制使得藻細(xì)胞在水中往往處于穩(wěn)定的懸浮狀態(tài)，很難像活性污泥那樣通過重力沉淀實(shí)現(xiàn)分離。然而自然界中存在絮凝性藻類，1965年Golueke等發(fā)現(xiàn)池塘中的微藻在溫度較高且光線充足的時(shí)候能自然形成絮體。此后很多研究都證實(shí)了該現(xiàn)象的存在，目前基本認(rèn)為微藻自絮凝是由兩種機(jī)制引發(fā)的：(1)高pH條件下鈣、鎂等離子形成帶正電的沉淀物，起到電性中和作用從而引發(fā)絮凝，(2)部分藻種在生理活動中產(chǎn)生具有絮凝作用的胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances，EPS)，EPS起到生物絮凝劑的作用從而引發(fā)絮凝。一些研究認(rèn)為微藻絮體的形成過程也有絮凝性細(xì)菌的作用。微藻自絮凝能改善藻細(xì)胞沉降性、提高沉淀效率，然而自絮凝機(jī)理研究的相對缺乏極大限制了微藻污水處理技術(shù)的應(yīng)用。因此研究微藻自絮凝特性及機(jī)理，對解決微藻污水處理技術(shù)應(yīng)用中存在的藻細(xì)胞分離采收難題具有重要意義。

　　以往研究表明，小球藻表現(xiàn)出對各種污水環(huán)境良好的適應(yīng)性、出色的污水處理效能和一定的油脂生產(chǎn)能力，但對小球藻自絮凝特性及機(jī)理研究相對不足，尤其對應(yīng)用于污水處理的小球藻自絮凝特性缺乏了解。本文研究了污水處理小球藻自絮凝現(xiàn)象、絮體特性，初步探究了污水處理小球藻自絮凝機(jī)理，以期促進(jìn)微藻污水處理技術(shù)的理論發(fā)展和實(shí)際應(yīng)用。

　　一、材料與方法

　　1.1 藻種

　　從中國科學(xué)院淡水藻種庫購買藻種，主要研究能在污染水體中生存、分布廣泛、具有產(chǎn)油能力的Chlorellavulgaris(FACHB-8)作為研究藻種。用BG11(+N)培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，以穩(wěn)定期藻細(xì)胞作為接種藻種，接種到BG11(+N)、模擬生活污水中進(jìn)行試驗(yàn)研究。

　　1.2 模擬生活污水

　　2模擬生活污水以乙酸鈉(CODCr濃度為230~260mg/L)、NH4Cl(NH+4-N濃度為90~100mg/L)、KH2PO4(PO3-4-P濃度為7~9mg/L)分別作為有機(jī)碳源、氮源、磷源配制模擬生活污水，添加包含Mg、Ca、Fe、Zn、B、Mn、Cu、Co、Mo等微量元素的化學(xué)試劑，初始pH值控制在7.5~8.0。

　　1.3 光-SBR反應(yīng)器及運(yùn)行

　　采用兩個(gè)SBR反應(yīng)器平行運(yùn)行，分別命名為M1(BG11培養(yǎng)基，滅菌，透氣封口膜封閉)、M2(模擬生活污水，不滅菌，透氣封口膜封閉)。有效容積為500mL，置于磁力攪拌器上，攪拌速度為500r/min。將裝置整體置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件：溫度為(25±1)℃，光照強(qiáng)度為2000lux，光暗時(shí)間比為13∶11。SBR運(yùn)行周期為48h，沉淀時(shí)間為30min，排水比為60%。

　　1.4 微藻形態(tài)觀察

　　常規(guī)形態(tài)：采用生物顯微鏡(BX-51，Olympus，Japan)及數(shù)碼像機(jī)(SX600，Cannon，Japan)進(jìn)行。

　　掃描電子顯微鏡觀察，從反應(yīng)器中取出部分微藻，離心后去除上清液，加入2.5%戊二醛置于4℃冰箱中固定1.5h。用磷酸緩沖液沖洗3次，每次10min，分別用體積濃度為50%、70%、80%和90%的乙醇進(jìn)行脫水，每次10~15min，100%的乙醇脫水3次，每次10~15min。乙醇：乙酸異戊酯=1∶1、100%乙酸異戊酯各置換一次，每次15min，用臨界點(diǎn)干燥儀(HCP22，Hitachi，Japan)對樣品進(jìn)行干燥，將樣品觀察面向上粘貼在掃描電鏡樣品臺上，用離子濺射鍍膜儀(IB-5，Giko，Austria)在樣品表面鍍一層1500nm厚的金膜，將處理好的樣品用掃描電子顯微鏡(S-4300，Hitachi，Japan)進(jìn)行拍照觀察。

　　1.5檢測方法

　　COD、NH+4-N、PO3-4-P、MLSS等指標(biāo)采用國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法測定。沉淀效率計(jì)算如式(1)。

　　二、結(jié)果

　　2.1 微藻絮體形態(tài)變化

　　試驗(yàn)過程中不同底物條件下微藻絮體形態(tài)變化如圖1所示，M1與M2接種藻種相同，均為BG11(+N)培養(yǎng)基富集后穩(wěn)定期的小球藻。接種到BG11(+N)培養(yǎng)基-M1和模擬生活污水-M2中后，微藻聚集形態(tài)發(fā)生了明顯區(qū)別：M1中藻細(xì)胞密度增加、聚集形態(tài)仍為游離狀態(tài)為主，沒有發(fā)生藻細(xì)胞的聚集、粘附乃至絮凝，M2中運(yùn)行到第20d就出現(xiàn)了類似活性污泥絮體的松散絮體結(jié)構(gòu)，藻細(xì)胞粘附在絮體上，此后生物量進(jìn)一步增加、絮體進(jìn)一步增大，第60d時(shí)，M2中出現(xiàn)較為密實(shí)、尺寸較大的絮體。

　　2.2 沉淀效率變化

　　試驗(yàn)過程M1和M2中微藻沉淀效率變化如圖2所示。0~10d，兩個(gè)反應(yīng)器中微藻沉淀效率基本保持不變，該階段為微藻的適應(yīng)期。15d后，M2中微藻沉淀效率明顯改善，從0~10d的平均33.83%提高到80.40%(55~60d)，M1中微藻沉淀效率也有所提高，但沉降性依然較差，從0~10d的平均31.74%提高到43.03%(55~60d)。上述結(jié)果表明，短沉淀時(shí)間能改善微藻沉降性、提高沉淀效率，并且對開放的微藻污水處理系統(tǒng)中微藻沉淀效率的提高作用更加明顯。

　　2.3 微藻顯微結(jié)構(gòu)

　　如圖3所示，對M1、M2中的小球藻進(jìn)行掃描電鏡觀察，以研究微藻絮體及內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)。從M1中小球藻細(xì)胞的掃描電子顯微鏡照片，可以看出，細(xì)胞表面較為光滑、沒有其他形態(tài)的藻類、細(xì)菌生長。M2中微藻絮體的掃描電子顯微鏡照片顯示，藻細(xì)胞表面較為粗糙，粘附一些絲狀、膠狀物質(zhì)(胞外聚合物)，藻細(xì)胞黏附在絮體上，絮體內(nèi)部充滿大大小小的孔隙。絮體內(nèi)部除了球狀藻細(xì)胞外，沒有觀察到其他形態(tài)的藻細(xì)胞，但有大量的短桿菌、球菌。由于M1對基質(zhì)進(jìn)行滅菌處理、透氣封口膜封閉運(yùn)行，因此保持了單一的微藻種群，M2中未對模擬生活污水進(jìn)行滅菌處理，運(yùn)行過程滋生了大量細(xì)菌，掃描電鏡照片表明這些細(xì)菌在藻細(xì)胞絮凝過程中具有重要作用。

　　2.4 絮體元素含量變化及成分分析

　　對M1、M2中小球藻進(jìn)行掃描電鏡觀察的同時(shí)，利用能譜儀同步分析了主要元素的變化，結(jié)果如表1所示。由表1可知，基質(zhì)條件的不同造成M1、M2中生物質(zhì)元素含量具有明顯區(qū)別，M1中具有相對較高的Cl、K元素含量，而M2中具有相對較高的Na、P、Fe、Mg、Ca元素含量。P、Fe、Mg、Ca元素是污水處理系統(tǒng)中形成無機(jī)物沉淀的主要元素，對微藻絮體的沉降性具有改善作用。

　　如圖4所示，微藻絮體XRD圖譜分析結(jié)果，與Jade6.0軟件中的標(biāo)準(zhǔn)文檔進(jìn)行比較可知，衍射圖譜中大部分強(qiáng)峰與Ca4O(PO4)2一致。結(jié)合能譜分析結(jié)果，Ca、P元素在微藻自凝聚中具有重要作用。

　　三、討論

　　關(guān)于微藻自絮凝機(jī)理，目前比較公認(rèn)的是兩種機(jī)制：(1)高pH條件下Ca、P等離子形成帶正電的沉淀物，形成電性中和作用從而引發(fā)絮凝，(2)部分藻種在生理活動中產(chǎn)生具有絮凝作用的EPS，EPS起到生物絮凝劑的作用從而引發(fā)絮凝。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)菌藻共生體系中微藻具有良好的絮凝性，逐漸發(fā)展出絮凝性細(xì)菌輔助微藻絮凝的理論。

　　3.1 高pH誘導(dǎo)絮凝

　　1984年，Sukenik等首次定量、系統(tǒng)性地研究了高pH下的微藻自絮凝現(xiàn)象，認(rèn)為磷酸鈣是誘導(dǎo)自絮凝的關(guān)鍵沉淀物。Vandamme等在研究小球藻自絮凝時(shí)發(fā)現(xiàn)pH顯著影響絮凝效果。Sirin等在研究三角褐指藻的自絮凝時(shí)發(fā)現(xiàn)，pH值為10.5~11時(shí)生成的沉淀物主要為鎂沉淀物。上述研究將微藻自絮凝視為純粹的化學(xué)反應(yīng)過程，忽略了微藻生理生化過程引起的絮體內(nèi)部微環(huán)境pH改變以及細(xì)胞分泌物對藻細(xì)胞絮凝特性的影響。本研究中觀察到以模擬生活污水為底物的M2中具有相對較高的Na、P、Fe、Mg、Ca元素含量，已有研究表明，P、Fe、Mg、Ca元素在活性污泥絮凝、好氧顆?；芯哂兄匾饔谩；谠撐⒃遄孕跄龣C(jī)理，P、Fe、Mg、Ca元素在微藻絮體的形成中具有重要作用，但作用機(jī)制可能不僅限于pH條件改變引起的化學(xué)沉淀。

　　3.2 EPS引發(fā)絮凝

　　EPS是微生物細(xì)胞外一層黏性基質(zhì)，直接影響細(xì)胞表面特性，與廢水處理反應(yīng)器中微生物聚集體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能及生態(tài)均密切相關(guān)，在廢水生物處理中起重要作用。Zhang等研究表明，磷濃度能增加藻細(xì)胞生長和胞外有機(jī)物分泌。Boonchai等發(fā)現(xiàn)，饑餓處理后會引起微藻EPS產(chǎn)量的增加，氮饑餓條件下的微藻EPS具有相對較高的蛋白質(zhì)含量。He等發(fā)現(xiàn)，Mg2+/Ca2+能改變微藻EPS中蛋白質(zhì)的含量和類型，從而促進(jìn)藻細(xì)胞在硅片表面的粘附。Salim等發(fā)現(xiàn)，EPS在E.texensis細(xì)胞的自凝聚中起主要作用，細(xì)胞表面粘附的主要物質(zhì)為糖蛋白。Ge等發(fā)現(xiàn)，EPS中糖類/蛋白質(zhì)比能更好地反映微藻沉降性能，而不是簡單的EPS總量。這些研究表明EPS對微藻細(xì)胞表面特性、絮凝性能的影響十分顯著。M2中微藻細(xì)胞表面的絲狀、膠狀物質(zhì)就是胞外聚合物，因此，有必要從EPS的角度研究微藻自絮凝機(jī)理，探究EPS在微藻顆?；^程中的作用機(jī)制。

　　上述兩種自絮凝機(jī)制能較好地解釋實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下一些微藻的自絮凝現(xiàn)象，然而近年來在微藻污水處理系統(tǒng)的研究中，越來越多的證據(jù)表明細(xì)菌在微藻自絮凝過程中具有重要作用。

　　3.3 絮凝性細(xì)菌輔助絮凝

　　菌藻共生體系的絮凝現(xiàn)象很早就引起研究人員的注意。Lee等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lavobacterium、Terrimonas、Sphingobacterium對Chlorellavulgaris培養(yǎng)物絮凝活性影響顯著。一些絲狀真菌也具有良好的與藻細(xì)胞結(jié)合的能力，例如Rhizopusoryzae、Penicilliumexpansum和Mucorcircinelloides等與微藻共培養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化條件下可形成較大的顆粒(直徑為2~5mm)。M2中掃描電鏡照片觀察到絮體內(nèi)部具有大量的短桿菌、球菌，表明這些細(xì)菌在藻細(xì)胞絮凝過程中具有重要作用。

　　開放的污水處理系統(tǒng)中具有非常復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)，相應(yīng)地構(gòu)成復(fù)雜菌藻共生體系。微藻與細(xì)菌關(guān)系主要有兩類，互利共生-相互利用代謝產(chǎn)物、競爭抑制-對營養(yǎng)物質(zhì)的相互競爭。如何利用菌藻之間的互利共生關(guān)系，較好地構(gòu)建菌藻系統(tǒng)是將其應(yīng)用于污水處理的前提之一。本研究中細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定、菌-藻關(guān)系以及菌藻共生體形成機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

　　本研究中微藻自絮凝的現(xiàn)象無法以上述任一單一機(jī)理進(jìn)行解釋，尤其對開放的微藻污水處理系統(tǒng)，其作用過程包括藻-藻、菌-藻、菌-菌以及微藻、細(xì)菌與污水中物質(zhì)的多重作用。另外微藻、細(xì)菌生理生化過程對微環(huán)境條件的改變也十分復(fù)雜，因此有必要對微藻絮凝特性、過程以及機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，以便進(jìn)一步明確微藻自絮凝機(jī)理，從而指導(dǎo)微藻污水處理技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用。

　　四、結(jié)論

　　(1)以短沉淀時(shí)間運(yùn)行，環(huán)境選擇壓力下小球藻在模擬生活污水中會發(fā)生自絮凝，沉降性良好。

　　(2)污水處理小球藻藻細(xì)胞表面粗糙，粘附絲狀、膠狀物質(zhì)，絮體中含有大量短桿菌、球菌。

　　(3)污水處理小球藻具有相對較高的Na、P、Fe、Mg、Ca元素含量，絮體無機(jī)物質(zhì)中主要形態(tài)為Ca4O(PO4)2。

　　(4)污水處理小球藻自絮凝是在短沉淀構(gòu)成的環(huán)境選擇壓力誘導(dǎo)下，綜合胞外聚合物誘導(dǎo)絮凝、無機(jī)元素沉淀促進(jìn)絮凝以及絮凝性細(xì)菌輔助絮凝共同作用的結(jié)果。（ >

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