目前，生物脫氮技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在污水處理系統(tǒng)中.其中的硝化作用包括氨氧化細(xì)菌(AOB)將氨氮(NH+4-N)轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮(NO-2-N)及亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(NOB)再將NO-2-N轉(zhuǎn)化成硝酸鹽氮(NO-3-N)的過(guò)程.由于硝化細(xì)菌較低的增長(zhǎng)速率及對(duì)pH、溶解氧濃度、溫度、有毒化學(xué)品等具有極高的敏感性，因此，硝化作用一直被視為脫氮過(guò)程中的限速步驟.
重金屬銅(Cu)是一種重要工業(yè)原材料，被廣泛用于制革、電鍍、金屬加工等行業(yè)，其中，金屬加工、電鍍工廠所排放的廢水中Cu2+含量最高，濃度可達(dá)幾十至幾百mg · L-1.同時(shí)，含銅工業(yè)廢水還經(jīng)常會(huì)進(jìn)入市政污水系統(tǒng)，從而影響污水廠的生物硝化處理效果.研究發(fā)現(xiàn)，純培養(yǎng)的硝化細(xì)菌對(duì)Cu2+比較敏感，Cu2+的半抑制濃度(IC50)為13.3 mg · L-1.活性污泥體系中，硝化菌群對(duì)Cu2+的耐受性有所提高，50 mg · L-1的Cu2+可以抑制50%的NH+4-N降解速率.與其他重金屬(如Zn、Cd、Ni)相比，硝化性能受Cu抑制后需要更長(zhǎng)的恢復(fù)時(shí)間.由于不同試驗(yàn)中pH、污泥類型、污泥濃度及有機(jī)物質(zhì)等因素的差別，因此，不同研究得到的Cu2+對(duì)活性污泥的抑制效果往往有差異，但幾乎所有的報(bào)道都認(rèn)同高濃度的Cu2+對(duì)硝化反應(yīng)的抑制作用.目前，已有的研究多從動(dòng)力學(xué)角度考察Cu2+沖擊負(fù)荷對(duì)硝化效果的抑制，然而短期的沖擊實(shí)驗(yàn)不足以反映受持續(xù)毒性的抑制情況，而針對(duì)Cu2+持續(xù)負(fù)荷及負(fù)荷結(jié)束后硝化性能變化的研究還相對(duì)較少.
因此，本文主要采用間歇式活性污泥反應(yīng)器(SBR)，研究Cu2+持續(xù)負(fù)荷期間及結(jié)束后AOB和NOB硝化菌群活性的變化，通過(guò)檢測(cè)硝化效率、微生物活性、Cu分布特點(diǎn)等信息，探討Cu2+對(duì)生物硝化過(guò)程抑制的作用原理.
2 材料與方法
2.1 模擬生活污水和接種污泥
試驗(yàn)采用人工模擬生活污水，模擬污水COD為500 mg · L-1，NH+4-N 75 mg · L-1，pH=7.5±0.5，具體組分為(mg · L-1)：無(wú)水葡萄糖480，NH4Cl 75，KH2PO4 30，NaHCO3 350，MgSO4 · 7H2O 20，F(xiàn)eSO4 · 7H2O 2.5，ZnSO4 · 7H2O 0.25，CaCl2 · 2H2O 10，CoCl2 · 6H2O 0.00005，MoO3 0.0015.根據(jù)試驗(yàn)需要向模擬生活污水中投加適量硫酸銅儲(chǔ)備液(Cu2+濃度25 g · L-1)，配置不同濃度的含Cu生活污水.在pH為7.5左右的含銅進(jìn)水中，Cu2+可以和OH-(水解產(chǎn)物)、CO2-3(來(lái)自于350 mg · L-1 NaHCO3的HCO-3和CO2-3)、氨(來(lái)自于75 mg · L-1 NH4Cl的NH3)等形成溶解態(tài)Cu(OH)-n+2n、Cu(CO3)-2n+2n、 Cu(NH3)2+n等絡(luò)合物(后文統(tǒng)稱為Cu2+)，以及 Cu(OH)2和CuCO3等難溶物質(zhì).
接種污泥取自天津某污水處理廠A2O曝氣池，并用模擬生活污水在SBR中馴養(yǎng)至出水NH+4-N穩(wěn)定小于0.5 mg · L-1后開始試驗(yàn).
2.2 試驗(yàn)裝置
反應(yīng)器有效容積5 L，內(nèi)徑為100 mm，總高850 mm(圖 1).SBR運(yùn)行參數(shù)：自控裝置控制運(yùn)行周期，處理水量為2.5 L · 周期-1，每周期6 h，包括進(jìn)水5 min，曝氣240 min，靜沉75 min，排水10 min，靜置30 min;溫度(25.0±0.5)℃.進(jìn)水水箱中設(shè)有循環(huán)泵，確保進(jìn)水成份均勻.曝氣時(shí)控制反應(yīng)器內(nèi)DO≥2 mg · L-1.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中平均1天排1次泥，保證MLSS為5000 mg · L-1左右，污泥齡約為6 d.
圖 1 SBR反應(yīng)器裝置圖
2.3 試驗(yàn)方法
試驗(yàn)采用5個(gè)相同的SBR反應(yīng)器進(jìn)行持續(xù)負(fù)荷試驗(yàn).其中1個(gè)反應(yīng)器為對(duì)照體系，進(jìn)水始終為不含Cu2+的模擬污水.另外4個(gè)反應(yīng)器在第1~20周期內(nèi)的進(jìn)水為不含Cu2+的模擬污水，該階段為初始階段;第21周期后，4個(gè)反應(yīng)器的進(jìn)水變?yōu)楹珻u2+濃度分別為10、20、30和50 mg · L-1的模擬污水，該階段為抑制階段;當(dāng)各反應(yīng)器的出水NH+4-N保持穩(wěn)定后，停止向進(jìn)水中加Cu2+，系統(tǒng)進(jìn)入恢復(fù)階段.
2.4 生物活性的表征
AOB、NOB及異養(yǎng)菌的活性主要用氨氧化比耗氧速率(SOURNH4)、亞硝酸鹽氮氧化比耗氧速率(SOURNO2)和碳氧化比耗氧速率(SOURorg.C)來(lái)表征.活性污泥各項(xiàng)SOUR的測(cè)定參見(jiàn)文獻(xiàn).微生物活性的抑制率I用下式計(jì)算：
式中，SOURck為對(duì)照組SOUR(mg · g-1 · min-1，以MLSS計(jì))，SOURexp為各實(shí)驗(yàn)組SOUR(mg · g-1 · min-1，以MLSS計(jì)).
恢復(fù)期，投加Cu2+的4個(gè)反應(yīng)器出水中NH+4-N和NO-3-N濃度變化率分別用kNH4和kNO3表示，其中，kNH4、kNO3可以用來(lái)評(píng)價(jià)AOB和NOB菌群的恢復(fù)速率.
式中，CNH4是出水中NH+4-N濃度(mg · L-1)，CNO3是出水中NO-3-N濃度(mg · L-1)，t是周期數(shù)，kNH4為恢復(fù)期NH+4-N的消耗速率(mg · L-1· 周期-1)，kNO3為恢復(fù)期NO-3-N的生成速率(mg · L-1· 周期-1).
2.5 反應(yīng)體系中Cu的分布
反應(yīng)器體系內(nèi)的總銅、溶解態(tài)銅、活性污泥內(nèi)部的銅、活性污泥表面吸附的銅可以反映銅在體系內(nèi)的分布，結(jié)合硝化作用的抑制可分析出銅對(duì)硝化細(xì)菌的影響.測(cè)定活性污泥內(nèi)部的銅主要運(yùn)用洗脫液(1 mmol · L-1 EDTA，pH=7.0，0.1 mol · L-1 NaCl)洗脫泥樣后測(cè)定的方法.洗脫液使活性污泥表面吸附的銅解吸附，洗脫后殘留在泥樣內(nèi)的銅被認(rèn)為是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的銅.將用洗脫液洗脫后的泥樣、過(guò)濾后的水樣、泥水混合樣加酸進(jìn)行微波消解后，用火焰原子吸收儀測(cè)定銅的濃度，分別得到活性污泥內(nèi)部的銅、溶解態(tài)銅、總銅含量.總銅減去溶解態(tài)銅和活性污泥內(nèi)部的銅后可得到活性污泥表面吸附的銅.
2.6 常規(guī)測(cè)試項(xiàng)目
COD：COD消解儀+分光光度法;NH+4-N：納氏試劑分光光度法;硝酸鹽氮：酚二磺酸光度法;亞硝酸鹽氮：N-(1-萘基)-乙二胺光度法;MLSS：重量法;DO和pH：在線測(cè)定儀.
3 結(jié)果與討論
3.1 Cu2+的持續(xù)負(fù)荷對(duì)系統(tǒng)處理性能的影響
各反應(yīng)器在初始階段硝化效果良好，出水NH+4-N均低于0.5 mg · L-1，NH+4-N去除率均大于99%(圖 2a).第20周期，進(jìn)水變?yōu)楹珻u2+污水后，Cu2+對(duì)NH+4-N去除的抑制作用隨著Cu2+濃度和運(yùn)行周期變化顯著.在10、20、30和50 mg · L-1 Cu2+的抑制下，NH+4-N去除率分別在第84、72、28和24周期開始迅速下降，在第100、96、58和42周期分別降至31.3%、29.3%、27.1%和22.5%.各反應(yīng)器初始階段，出水NO-2-N濃度低于1 mg · L-1(圖 2b);進(jìn)水改為含Cu2+污水后，各反應(yīng)器都首先出現(xiàn)了NO-2-N積累現(xiàn)象，隨后NO-2-N以不同速率降低.出水NO-3-N在10和20 mg · L-1 Cu2+體系中的降低出現(xiàn)較晚且緩慢(圖 2c)，而30和50 mg · L-1 Cu2+體系中NO-3-N在抑制周期內(nèi)很快由(37.0±2.0)mg · L-1降至(1.0±0.5)mg · L-1.在10、20 mg · L-1 Cu2+體系的抑制初期，出水NH+4-N濃度保持穩(wěn)定，而出水NO-2-N濃度先增加后降低，表明體系中NOB受到抑制后逐漸被完全或者部分馴化，從而逐漸適應(yīng)含Cu2+的環(huán)境.在30、50 mg · L-1 Cu2+體系中，出水NH+4-N濃度提高，表明高濃度的Cu2+對(duì)AOB和NOB都產(chǎn)生了嚴(yán)重抑制.
圖 2 SBR系統(tǒng)受含Cu2+廢水抑制及系統(tǒng)恢復(fù)階段的運(yùn)行效果
SCOD的去除同樣受到Cu2+影響，當(dāng)進(jìn)水Cu2+為10、20 mg · L-1時(shí)Cu2+對(duì)SCOD的去除影響較小，出水SCOD從(10±5)mg · L-1上升至(20±5)mg · L-1(圖 2d)，表明異養(yǎng)菌活性受低濃度Cu2+的毒性影響較小;而當(dāng)廢水中Cu2+濃度為30 mg · L-1時(shí)，出水SCOD經(jīng)12個(gè)周期后增至(100±5)mg · L-1，但隨后微生物逐漸適應(yīng)Cu2+負(fù)荷，經(jīng)過(guò)10個(gè)周期運(yùn)行后，出水SCOD降至(30±5)mg · L-1，表明該濃度下異養(yǎng)菌能逐漸被馴化;50 mg · L-1 Cu2+體系中，出水SCOD隨運(yùn)行時(shí)間呈上升趨勢(shì)，最高達(dá)到370 mg · L-1.根據(jù)理論計(jì)算，異養(yǎng)菌降解500 mg · L-1的COD(480 mg · L-1葡萄糖，C6H12O6)需消耗31 mg · L-1左右的NH+4-N，這與10、20和30 mg · L-1 Cu2+體系抑制穩(wěn)定時(shí)NH+4-N的去除量((28±3)mg · L-1)較接近.因此，在抑制試驗(yàn)運(yùn)行末期，10、20和30 mg · L-1 Cu2+體系中NH+4-N的去除主要是異養(yǎng)菌代謝的結(jié)果，硝化作用被完全抑制.但在50 mg · L-1 Cu2+體系中，在抑制試驗(yàn)運(yùn)行末期，NH+4-N去除量?jī)H為15 mg · L-1左右，小于異養(yǎng)菌正常代謝消耗的NH+4-N，說(shuō)明高濃度Cu2+對(duì)異養(yǎng)菌也產(chǎn)生了抑制，這與50 mg · L-1 Cu2+體系中SCOD的去除率降低相一致.
3.2 Cu2+的持續(xù)負(fù)荷后生物硝化效率的恢復(fù)
10、20、30和50 mg · L-1 Cu2+的進(jìn)水反應(yīng)體系分別在第107、100、75和51周期抑制達(dá)到穩(wěn)定，進(jìn)水中然后停止投加Cu2+，進(jìn)入恢復(fù)階段.硝化效率在10 mg · L-1 Cu2+體系中恢復(fù)較快，恢復(fù)13個(gè)周期(第120周期)后，NH+4-N去除率恢復(fù)到初始階段的水平(圖 2a);20、30、50 mg · L-1 Cu2+體系在分別恢復(fù)了19、44、69個(gè)周期后，NH+4-N去除率達(dá)到初始階段的48.8%、34.8%、46.2%.恢復(fù)期內(nèi)，10、20、30 mg · L-1 Cu2+體系中NO-2-N無(wú)明顯積累，體系中生成的NO-2-N能被氧化成NO-3-N.50 mg · L-1 Cu2+體系中，恢復(fù)初期NH+4-N去除率的提高并沒(méi)有伴隨NO-2-N或者NO-3-N明顯生成，說(shuō)明此時(shí)NH+4-N的消耗可能不是硝化菌的作用.此時(shí)50 mg · L-1 Cu2+體系中SCOD的去除效率恢復(fù)到初始階段的水平，根據(jù)3.1節(jié)中關(guān)于異養(yǎng)菌消耗NH+4-N的討論，此時(shí)50 mg · L-1 Cu2+體系中NH+4-N的消耗主要是恢復(fù)活性的異養(yǎng)菌代謝的結(jié)果.恢復(fù)末期，50 mg · L-1 Cu2+體系中出水NH+4-N繼續(xù)降低，NO-3-N生成，并出現(xiàn)NO-2-N積累現(xiàn)象，這主要是因?yàn)殡S著運(yùn)行周期的延長(zhǎng)，AOB、NOB均有一定程度的恢復(fù)，而且AOB恢復(fù)速度比NOB快.根據(jù)公式(2)、(3)，恢復(fù)期各反應(yīng)體系的出水中NH+4-N消耗速率和NO-3-N的生成速率分別為kNH4=0.24~5.20 mg · L-1 · 周期-1，kNO3=0.04~2.59 mg · L-1 · 周期-1.kNH4和kNO3均隨投加Cu2+濃度的增加而降低，表明在抑制期投加Cu2+的濃度越高的體系中AOB和NOB恢復(fù)速率越慢(圖 3).當(dāng)Cu2+投加濃度相同時(shí)，kNH4大于kNO3，但此時(shí)并沒(méi)有NO-2-N積累，這可能是由于異養(yǎng)菌活性也在恢復(fù)，其消耗的NH+4-N量也在增加.
圖 3 SBRs反應(yīng)器恢復(fù)期的氨氮消耗速率(a)和硝酸鹽氮生成速率(b)
3.3 Cu2+持續(xù)負(fù)荷對(duì)生物硝化菌群活性的抑制及活性恢復(fù)效果
氨氧化SOURNH4和亞硝酸鹽氮氧化SOURNO2分別表征了AOB和NOB的活性變化.如圖 4a所示，未投加Cu2+時(shí)，SOURNH4和SOURNO2分別為0.147和0.098 mg · g-1 · min-1(以MLSS計(jì)).抑制試驗(yàn)穩(wěn)定期時(shí)，10、20、30和50 mg · L-1 Cu2+體系的SOURNH4抑制率分別達(dá)到89.1%、91.8%、95.2%和95.9%，SOURNO2的抑制率分別達(dá)到16.4%、46.3%、72.5%和94.9%.說(shuō)明Cu2+對(duì)硝化細(xì)菌的抑制作用明顯，并且對(duì)AOB的抑制作用大于NOB，即使低濃度的Cu2+也能使AOB基本失活.恢復(fù)試驗(yàn)?zāi)┢冢?0、20、30和50 mg · L-1 Cu2+體系中SOURNH4分別恢復(fù)了60.4%、12.6%、5.8%和3.9%，SOURNO2分別恢復(fù)了9.0%、8.1%、4.8%和3.2%，說(shuō)明AOB和NOB隨恢復(fù)時(shí)間的增加能逐漸恢復(fù)部分活性，Cu2+濃度越低，恢復(fù)越快.
圖 4 Cu2+投加濃度對(duì)SOUR的影響(a.抑制穩(wěn)定期SOUR;b.恢復(fù)末期SOUR)
表征異養(yǎng)微生物活性的SOURorg.C受10、20、30 mg · L-1的Cu2+持續(xù)負(fù)荷影響較小，而受50 mg · L-1的Cu2+負(fù)荷影響較大.對(duì)照組的SOURorg.C為0.503 mg · g-1 · min-1(以MLSS計(jì)).抑制穩(wěn)定期時(shí)，10、20、30和50 mg · L-1體系中SOURorg.C抑制率分別為13.8%、21.5%、24.5%和80.0%，這和SCOD的降解抑制率較為相符;恢復(fù)試驗(yàn)?zāi)┢冢鞣磻?yīng)器SOURorg.C恢復(fù)至初始階段的80%±10%.由此可見(jiàn)，當(dāng)Cu2+濃度≤30 mg · L-1時(shí)，Cu2+對(duì)異養(yǎng)菌的活性抑制程度較小且易恢復(fù);當(dāng)Cu2+濃度為50 mg · L-1時(shí)，Cu2+對(duì)異養(yǎng)菌的活性抑制程度較大，僅能部分恢復(fù).
3.4 反應(yīng)體系內(nèi)Cu的分布和積累
在反應(yīng)體系內(nèi)銅的分布主要有3種形式：溶解態(tài)銅、活性污泥內(nèi)部的銅和活性污泥吸附的銅;三者之和為體系內(nèi)總銅.銅在SBR內(nèi)顯著積累，表明活性污泥對(duì)銅的吸附能力很強(qiáng).在10、20、30和50 mg · L-1 Cu2+體系中活性污泥內(nèi)部的銅分別占總銅的35.9%、36.7%、36.1%和35.4%，活性污泥吸附的銅分別占總銅的62.4%、59.6%、60.0%和56.8%(圖 5).由此可見(jiàn)，在不同濃度體系中銅在三相中的分布比例基本相近，其中，活性污泥吸附的銅大于進(jìn)入活性污泥內(nèi)部的銅.將NH+4-N去除率與活性污泥吸附和內(nèi)部的銅分別進(jìn)行相關(guān)分析，未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)關(guān)系(圖 6a和b，p>0.05).在持續(xù)的銅負(fù)荷下，當(dāng)活性污泥內(nèi)部和其表面吸附的銅分別積累到(5.0±0.5)和(9.0±0.5)mg · g-1(以MLSS計(jì))時(shí)，各濃度體系的NH+4-N降解去除率急劇下降.Hu等(2003)的研究表明，銅對(duì)硝化細(xì)菌抑制與細(xì)胞吸附和細(xì)胞內(nèi)部的銅濃度無(wú)明顯線性關(guān)系，此結(jié)果和本文相一致.各濃度體系中NH+4-N去除率與溶解態(tài)銅濃度呈負(fù)相關(guān)性(p<0.05)，NH+4-N去除率隨體系內(nèi)溶解態(tài)銅濃度的增加不斷降低(圖 6c).Ochoa-Herrera等(2011)研究銅對(duì)硝化細(xì)菌的沖擊試驗(yàn)時(shí)表明，相比總銅濃度而言，溶解態(tài)銅能更好地反映硝化的抑制情況.
圖 5 四個(gè)SBRs中銅的分布情況(a.抑制穩(wěn)定期;b.恢復(fù)25周期后)
圖 6 不同形態(tài)的銅和氨氮去除率的相關(guān)性(a.活性污泥內(nèi)部的銅;b.活性污泥吸附的銅;c.溶解態(tài)的銅)
各體系分別恢復(fù)25個(gè)周期后，反應(yīng)體系內(nèi)的總銅減少并不明顯，相較于各自抑制穩(wěn)定期，10、20、30和50 mg · L-1 Cu2+體系中活性污泥內(nèi)的銅分別減少14.4%、15.1%、16.4%和16.2%，活性污泥吸附的銅分別減少14.8%、13.0%、10.1%和10.3%，溶解態(tài)銅分別減少了47.6%、37.8%、27.9%和26.6%(此時(shí)溶解態(tài)的銅濃度分別為0.58、1.83、2.32、5.02 mg · L-1).結(jié)果表明，活性污泥內(nèi)部及其表面吸附的銅不易解析出來(lái)，且殘余濃度降低比例相近，但溶解態(tài)銅在不同濃度體系中降低的量差異較大，降低的比例越大，NH+4-N去除率恢復(fù)速率越快，且恢復(fù)程度越大.所以，恢復(fù)過(guò)程同樣體現(xiàn)了硝化的抑制率與溶解態(tài)銅濃度的相關(guān)性較好.
當(dāng)含銅廢水最初進(jìn)入反應(yīng)體系后，大量的銅被活性污泥固定，體系內(nèi)溶解態(tài)銅濃度很快降低.這可能由于活性污泥的吸附作用促進(jìn)了反應(yīng)器中Cu(OH)2、CuCO3的生成和沉淀，從而產(chǎn)生的銅聚合物沉積在菌體表面，被活性污泥捕獲.隨著Cu的不斷投加，無(wú)法被固定的銅參與到氧化還原體系中生成羥基自由基，從而破壞了細(xì)胞膜功能.低濃度Cu2+體系中(10、20 mg · L-1)，銅投加濃度小，較晚達(dá)到吸附飽和，且溶解態(tài)銅濃度也較低，參與氧化還原的銅相對(duì)較少，對(duì)AOB細(xì)胞膜未產(chǎn)生不可逆的影響，所以恢復(fù)期硝化能力較易恢復(fù).高濃度Cu2+體系中(50 mg · L-1)，銅投加量較大，很快達(dá)到飽和量，溶解態(tài)銅濃度較高從而嚴(yán)重破壞了AOB細(xì)胞膜，導(dǎo)致氨氧化性能急劇下降，恢復(fù)過(guò)程也較為緩慢.與AOB抑制情況不同，從抑制穩(wěn)定期的亞硝酸鹽氧化性能和NOB的耗氧速率的變化可看出，NOB菌群能逐漸被馴化從而適應(yīng)低濃度銅的環(huán)境.也提出在重金屬的影響下，AOB比NOB更易受到抑制.
4 結(jié)論
1)SBR活性污泥系統(tǒng)中硝化效率較易受到Cu2+的持續(xù)負(fù)荷影響，對(duì)NH+4-N去除的抑制作用隨著Cu2+濃度的增大和運(yùn)行周期的延長(zhǎng)變得顯著.在抑制期，進(jìn)水中持續(xù)的10、20、30和50 mg · L-1的Cu2+負(fù)荷使NH+4-N去除率分別在抑制87、80、55、31個(gè)周期之后降低至31.3%、29.3%、27.1%、22.5%.在恢復(fù)階段，AOB和NOB的恢復(fù)速率隨著抑制期投加Cu2+濃度的增加而降低.10~20 mg · L-1 Cu2+體系中，NOB可以被全部或者部分馴化，10~30 mg · L-1 Cu2+的體系內(nèi)，異養(yǎng)菌可以全部被馴化.
2)Cu2+對(duì)硝化細(xì)菌的活性抑制作用明顯.在抑制期，Cu2+濃度為10~50 mg · L-1時(shí)，AOB活性抑制率為89.1%~95.5%，NOB抑制率為16.4%~94.9%，異養(yǎng)菌抑制率為13.8%~80.0%.各體系中Cu2+對(duì)菌群的抑制率為：AOB>NOB>異養(yǎng)菌.
3)抑制期，各系統(tǒng)內(nèi)銅主要分布在細(xì)胞內(nèi)部和表面，且恢復(fù)過(guò)程中不易解析.當(dāng)活性污泥內(nèi)部和其表面吸附的銅分別積累到(5.0±0.5)和(9.0±0.5)mg · g-1(以MLSS計(jì))時(shí)，各濃度體系的NH+4-N降解去除率急劇下降.硝化抑制率與溶解態(tài)的銅濃度呈負(fù)相關(guān).
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