厭氧生物處理技術因具有高有機負荷、低能耗及產能等優(yōu)點而被逐漸廣泛地應用到各類高濃度有機廢水的治理中.然而，廢水的來源各異，且含有多種對厭氧微生物有害的成分，其中，亞硝氮、硝氮、氨氮是厭氧處理過程中可能遇到的難題之一.亞硝氮、硝氮和氨氮進入?yún)捬醵慰赡艽嬖诤芏嗲闆r，如基于短程反硝化的厭氧產甲烷同時反硝化的提出和污水處理系統(tǒng)中好氧池污水回流脫氮等情況均會帶來亞硝酸鹽;果膠加工、炸藥與金屬制造及肥料應用的廢水處理，以及厭氧產甲烷同時反硝化工藝的提出等都有可能帶來一定濃度的硝酸鹽;一些畜禽廢物或食品加工廢水的處理，以及含有較多如尿素和蛋白質等氨氮成分的廢水處理等均會導致氨氮含量過高.
目前，針對這3種含氮無機化合物(亞硝氮、硝氮和氨氮)對厭氧微生物活性影響的研究多集中于對產甲烷活性和產甲烷菌的影響分析，而對厭氧細菌群落的急性影響研究還相對較少，僅有的研究也多偏向于氨氮部分，且缺乏這3種含氮無機化合物對厭氧細菌群落抑制作用的對比研究.復雜有機物的厭氧消化過程由一系列不同的微生物共同進行，主要包括發(fā)酵細菌，同型產乙酸細菌、產氫產乙酸菌及產甲烷菌.在厭氧群落中各類微生物之間協(xié)調互動，任何一類微生物受到抑制都將對整個系統(tǒng)造成影響.據(jù)對厭氧塘細菌和古生菌群落的定量PCR分析顯示，厭氧 微生物中細菌的數(shù)量超過古生菌數(shù)量3個數(shù)量級以上，厭氧細菌群落在厭氧微生物群落結構中占很大比重，因此，研究這3種含氮無機化合物對厭氧細菌群落的影響具有重要意義.
磷脂脂肪酸(PLFA)法可以通過磷脂脂肪酸圖譜對微生物群落進行快速有效的定量分析，且具備樣品易保存、脂肪酸成分不易受影響、實驗條件要求低、操作簡便等優(yōu)點.PLFA為甲基化活性污泥中提取磷脂后得到的脂肪酸產物，具有屬的特異性，某一類PLFA總會出現(xiàn)在同一類群微生物中，且僅存在于活體細胞中.脂肪酸通常的命名格式為X：Y wZ(c/t)，其中，X為總碳數(shù)，Y表示雙鍵數(shù)，w表示甲基末端，Z是距離甲基的距離，c表示順式，t表示反式，其他字符如a和i分別表示支鏈的反異構和異構，10Me表示一個甲基團在距分子末端第10個碳原子上，環(huán)丙烷脂肪酸用cy表示.微生物細菌種群結構可以通過微生物各類群的特征脂肪酸的相對含量表示，磷脂脂肪酸生物標記可反映厭氧細菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、放線菌和真菌等的相對含量.據(jù)相關報道可知，厭氧微生物群落中厭氧細菌優(yōu)勢種群多為革蘭氏陽性、革蘭氏陰性.多種支鏈脂肪酸可以表征革蘭氏陽性菌，單不飽和脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸可以用來指示革蘭氏陰性菌，一些特定的磷脂脂肪酸(如18:1 w7c、15:0 a、15:0 i、16:0 i、17:0 i、19:0 cy等)則可用于表征厭氧細菌.因此，本文利用微生物磷脂脂肪酸(PLFA)的變化表征細菌微生物群落結構，以期為抑制物質對厭氧微生物活性及細菌群落的急性影響作進一步的解釋，并為含這3種無機氮化合物的工業(yè)廢水的厭氧處理提供理論依據(jù).
2 材料與方法
2.1 厭氧顆粒污泥
厭氧顆粒污泥取自某制藥集團的工業(yè)UASB反應器.污泥呈黑色，粒徑為1.0~2.5 mm，濕污泥VSS/SS值為0.83.污泥經(jīng)淘洗后，加入葡萄糖人工配水在中溫(35 ℃)下進行間歇培養(yǎng)，經(jīng)1個月馴化穩(wěn)定后進行實驗.
2.2 人工配水和無機氮化合物貯備液
人工配水(mg · L-1)：葡萄糖2500，NH4Cl 280，NaHCO3 5000，K2HPO4 250，CaCl2 · 2H2O 10，MgCl2 · 6H2O 100，MgSO4 · 7H2O 100，酵母膏100，微量元素濃縮液(1 mL.
NaNO2(40 g · L-1，以N計)、NaNO3(40 g · L-1，以N計)和NH4Cl(50 g · L-1，以N計)貯備液由NaNO2(分析純)、NaNO3(分析純)和NH4Cl(分析純)分別溶解于去離子水配制.
2.3 實驗方法
在100 mL血清瓶中加入60 mL配水，pH穩(wěn)定在7.3±0.3，分別向3組血清瓶中加入一定量的NaNO2、NaNO3和NH4Cl貯備液，具體抑制物質及濃度情況見表 1.加入40 mL厭氧顆粒污泥，使用高純氮氣吹脫約5 min去除血清瓶中的溶解氧，密封后置于35 ℃恒溫水浴振蕩器中進行培養(yǎng)，每個濃度梯度設3個平行.
表1 抑制物質及濃度情況
根據(jù)空白組COD去除率達到90%的時間(5 d)以確定取樣時間.取出不同組的上清液樣品對其COD進行測定，取出顆粒污泥并選擇部分污泥樣品進行掃描電鏡分析和磷脂脂肪酸測定.
2.4 分析項目和方法
磷脂脂肪酸(PLFA)測定：PLFA提取方法根據(jù)牛川等方法進行并做適當修改，PLFA生物標記優(yōu)勢菌種分類方法根據(jù)牛川等方法進行，數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS進行統(tǒng)計分析.
PLFA具體提取方法如下：①提取與分離：取5 mL厭氧污泥離心去上清液，加入15 mL提取液(甲醇 ∶ 氯仿 ∶ 磷酸緩沖液=2 ∶ 1 ∶ 0.8，體積比)，渦旋振蕩1 min，室溫下往復式振蕩16 h，靜置10 min，收集上清液;再加15 mL提取液渦旋振蕩1 min，室溫下往復式振蕩2 h，靜置10 min，收集上清液;合并上清液，加入2.5 mL氯仿和2.5 mL無菌水，振蕩1 min，取下層液體在40 ℃電熱干浴用氮氣吹干，然后用1 mL氯仿溶出;氯仿提取樣品用硅酸柱洗脫，在5 mL甲醇洗脫液中加入50 mg · L-1內標十九烷酸100 μL，在40 ℃電熱干浴用氮氣吹干，后用1 mL氯仿溶出;②皂化：加入1 mL試劑1(NaOH ∶ 甲醇 ∶ 蒸餾水=45 g ∶ 150 mL ∶ 150 mL)，擰緊蓋子振蕩5~10 s后，置沸水浴5 min，振蕩5~10 s后再放置于沸水浴中25 min，取出后用冰浴冷卻;③甲基化：加入2 mL試劑2(6 mol · L-1 HCl ∶ 甲醇=325 mL ∶ 275 mL)，渦旋振蕩，80 ℃加熱保溫10 min，取出后冰浴冷卻;④萃?。杭尤?.25 mL試劑3(正己烷 ∶ 甲基叔丁醚=200 mL ∶ 200 mL)，振蕩提取PLFA甲酯，吸取上層正己烷相;⑤洗滌：加3 mL 1.2%的NaOH溶液，搖動5 min，吸取上層溶液轉入氣相色譜瓶.
PLFA采用安捷倫7890A氣相色譜測定，氣相色譜各參數(shù)由MIDI Sherlock程序設置調用.掃描電鏡分析：污泥樣品預處理方法根據(jù)方法進行.CODCr等按照《水和廢水監(jiān)測分析方法》測定.
3 結果
3.1 不同抑制物質及濃度下COD去除率情況
不同NO-2-N、NO-3-N和NH+4-N濃度條件下COD的去除率情況如圖 1所示，進水COD值均為(1958±4.64)mg · L-1，空白組的COD去除率為93.23%.由于抑制作用，3種抑制物質作用下的COD去除率均隨抑制物濃度升高呈下降趨勢，A組(亞硝氮組)和B組(硝氮組)的抑制趨勢較為接近，C組(氨氮組)與前兩組有明顯區(qū)別.A組中，低濃度的亞硝氮并未對COD去除率造成嚴重影響，40 mg · L-1亞硝氮使COD去除率降低至46.97%，亞硝氮濃度高達360 mg · L-1時COD去除率降至最低即3.49%;B組中，低濃度硝氮(15、30、60、120 mg · L-1)對COD去除率的抑制作用不明顯，210 mg · L-1硝氮使COD去除率下降至40.86%，硝氮濃度高達300 mg · L-1時COD去除率下降至10.85%;C組中，隨著氨氮濃度的升高，COD去除率呈坡度下降趨勢，但下降趨勢并不急劇，濃度最高達3000 mg · L-1時COD去除率僅下降至71.53%.
圖1 不同濃度NO-2-N、NO-3-N和NH+4-N條件下COD的去除率情況(橫坐標各組對應的具體濃度值見表 1)
研究發(fā)現(xiàn)，硝氮對顆粒污泥抑制作用50 h后，隨著硝氮濃度從75 mg · L-1增加到300 mg · L-1，顆粒污泥對COD的降解速率從402.72 mg · h-1 · g-1降至171.59 mg · h-1 · g-1，而低濃度硝氮條件下厭氧顆粒污泥的COD去除效果無明顯變化，表明顆粒污泥在低濃度的硝氮負荷下具有一定的抵御能力，與本實驗結論相近，這可能是由于低濃度下抑制物在顆粒污泥中遷移傳質受到限制.雖然低濃度硝氮和亞硝氮作用顆粒污泥5 d后COD去除率未明顯下降，但在測定厭氧微生物活菌百分比時發(fā)現(xiàn)，顆粒污泥中厭氧微生物的活菌百分比發(fā)生下降(如60 mg · L-1的亞硝氮和硝氮分別使厭氧微生物的活菌百分比降低至68.8%和74.9%).通過對系統(tǒng)中氨氮濃度的測定發(fā)現(xiàn)，C組中的氨氮在系統(tǒng)中的濃度隨時間幾乎沒有明顯變化，這可能是由于在厭氧污泥體系中能夠利用氨氮的微生物較少，抑制是一直存在的，因此，氨氮組即使在較低濃度也會出現(xiàn)COD下降現(xiàn)象.
3.2 顆粒污泥表觀形態(tài)變化
根據(jù)3.1節(jié)中的COD去除率變化選擇具有代表性的濃度組(A組：A2、A4、A6;B組：B2、B4、B6;C組：C1、C3、C5)進行各項指標的測定.圖 2為放大10000倍后的顆粒污泥的掃描電鏡圖.由圖 2可見，空白組厭氧顆粒污泥表面幾乎為8~25 μm長的桿狀菌，伴隨有少量的球菌，污泥表面凹凸不平孔隙交錯，是內部微生物能量代謝的重要通道.在高濃度的亞硝氮、硝氮和氨氮(A6、B6和C5)作用下，厭氧顆粒污泥的表面結構都發(fā)生明顯變化，污泥表面的主要細菌由桿狀菌變?yōu)榍驙罹?，幾乎不見桿菌.低濃度抑制作用下，污泥表面主要細菌為桿菌和球狀菌，且與空白組相比桿菌比例明顯降低.
圖2 不同條件下厭氧顆粒污泥掃描電鏡圖(×10000)
3.3 PLFA生物標記及脂肪酸分類分析
各組樣品的PLFA組成情況如表 2所示，其中，在各組樣品中含量比均低于0.5%的PLFA因含量過低而不具體列出，磷脂脂肪酸的碳鏈長度主要分布在C10~C20之間，共檢測到31種類型的磷脂脂肪酸，其中，占主要比重的磷脂脂肪酸為C15:0 a和C16:00.表 2中，與空白相比，A組和B組中的C15:0 a含量隨著抑制物質濃度的升高呈現(xiàn)下降趨勢，而C15:0 a在指示厭氧細菌和革蘭氏陽性菌的PLFA中占有較高負荷.C組的C17:1 w8c與空白相比隨著抑制物質濃度升高呈現(xiàn)下降趨勢，且C17:1 w8c為指示革蘭氏陰性菌的PLFA的主要因子.
表2 厭氧顆粒污泥整體磷脂脂肪酸情況
本實驗基于表 2數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，通過PLFA生物標記優(yōu)勢菌種研究了這3種抑制物質對厭氧細菌群落的影響，各樣品中PLFA生物標記優(yōu)勢菌種變化如圖 3所示.由圖 3可知，所有樣品的優(yōu)勢菌種均為革蘭氏陽性菌和厭氧細菌.在亞硝氮、硝氮和氨氮存在下，微生物細菌群落結構均發(fā)生了變化;亞硝氮和硝氮對生物標記優(yōu)勢菌種的影響呈現(xiàn)一定的相似性，氨氮的抑制效果區(qū)別于前兩者.A組中，隨著亞硝氮濃度的上升，厭氧細菌和革蘭氏陽性菌的百分比呈現(xiàn)下降趨勢，高濃度亞硝氮(360 mg · L-1)使厭氧細菌含量由37.71%下降至16.09%，革蘭氏陽性菌含量由44.04%下降至19.73%，革蘭氏陰性菌呈現(xiàn)出先下降后略微上升的趨勢.目前，有關亞硝氮和硝氮對厭氧細菌群落結構的影響還鮮見報道，多偏向于對生物除磷系統(tǒng)微生物群落的影響研究.如研究了亞硝氮對強化生物除磷系統(tǒng)的影響，結果表明，亞硝氮的存在改變了微生物群落結構且群落組成無法恢復，聚糖菌(GAOs)相比聚磷菌(PAOs)具有更強的抵抗力和恢復能力.B組中，隨著硝氮濃度的上升，厭氧細菌和革蘭氏陽性菌同樣呈現(xiàn)下降趨勢，高濃度硝氮(300 mg · L-1)使厭氧細菌含量下降至26.32%，革蘭氏陽性菌含量下降至23.85%，而革蘭氏陰性菌無明顯變化規(guī)律.C組中，隨著氨氮濃度的上升，厭氧細菌和革蘭氏陽性菌基本無明顯變化，革蘭氏陰性菌具有一定的下降趨勢，高濃度氨氮(3000 mg · L-1)使革蘭氏陰性菌含量由14.72%下降至10.51%.Calli等研究了450 d內6000 mg · L-1氨氮對厭氧微生物的影響，結果表明，產乙酸菌比產甲烷菌對氨氮的敏感性更高，而產乙酸菌如Clostridium aceticum、Acetobacterium woodii等多為革蘭氏陽性菌.在研究氨氮對高溫厭氧微生物的影響時發(fā)現(xiàn)，抑制時間為120 d時細菌優(yōu)勢菌種Firmicutes含量由原來的84.3%升高為94.7%，Actinobacteria含量由原來的7%下降為2.3%，而Firmicutes和Actinobacteria均為革蘭氏陰性菌.由此可見，氨氮雖對PLFA生物標記厭氧細菌和革蘭氏陽性菌的總量沒有明顯影響，但可能對其中不同種類微生物所占比重有影響.
圖3 PLFA生物標記優(yōu)勢菌種
3.4 主成分分析
主成分分析(PCA)可以通過不同樣品PLFA的狀況反映微生物種群的變化.主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分別含有62.71%和18.64%的差異度(圖 4).因子C15:0 i、C18:00、C13:00、C15:0 a、C16:00、C14:0 i、C16:0 i和C14:00在PC1上有較高的負荷，因子C17:00、C19:00、C18:1 w7c 11-methyl、C17:0 2OH、C17:0 i 3OH和C17:0 a在PC2上有較高的負荷.
由圖 4可以看出，PC1反映了不同抑制物質對PLFA的影響，PC2反映了不同抑制濃度對PLFA的影響.主成分分析顯示，各樣品間有較明顯的差異，A2、A4、A6、B6與空白之間的差異度較大，剩余樣品與空白之間的差異度相對較小.厭氧微生物的PLFA對亞硝氮的敏感度最高，即使低濃度的亞硝氮(A2)也會引起PLFA較大的變化;與亞硝氮不同，高濃度硝氮(B6)會引起PLFA較大變化，而低濃度(B2和B4)下與空白的差異度較小;氨氮(C1、C3和C5)對厭氧微生物PLFA的影響相對前兩者較小，且在濃度梯度上變化不大.
3.5 PLFA香農-威爾(Shannon-Wiener)多樣性分析
本文運用Shannon-Winener多樣性指數(shù)考察PLFA的豐富度和均勻度，來反映微生物種群的多樣性.Shannon-Winener多樣性指數(shù)通常被定義為：
其中，H為Shannon-Winener指數(shù)，s為樣品中磷脂脂肪酸的總數(shù)，pi為各磷脂脂肪酸所占百分比(Niu et al., 2012).
各樣品的Shannon-Winener多樣性指數(shù)見表 3.由表 3可知，與空白相比，亞硝氮導致微生物細菌種群多樣性下降，30 mg · L-1亞硝氮即可使PLFA多樣性指數(shù)下降至1.02，亞硝氮的濃度越高，微生物的PLFA多樣性指數(shù)越低;高濃度硝氮(如B4和B6)會導致PLFA多樣性下降，而低濃度硝氮(如B2)對PLFA多樣性指數(shù)并無明顯影響;氨氮組中，隨著氨氮濃度的升高，PLFA多樣性指數(shù)并無降低現(xiàn)象.
表3 各個樣品香農-威爾多樣性指數(shù)
亞硝氮和硝氮導致厭氧微生物PLFA多樣性指數(shù)下降，一方面可能歸因于反硝化功能菌群在污泥體系中的地位得以增強，另一方面可能是由于亞硝氮和硝氮對某些微生物具有直接的毒性作用，從而導致這部分微生物直接死亡.而氨氮的毒性作用并沒有影響微生物細菌群落的多樣性，這與Zhang等的研究結論相一致.
4 結論
1)亞硝氮和硝氮濃度低于120 mg · L-1時系統(tǒng)COD去除率無明顯變化，當二者濃度高于120 mg · L-1后隨濃度增加抑制作用增強;氨氮對COD去除率的抑制程度隨濃度的升高而增加.
2)高濃度的亞硝氮、硝氮和氨氮作用下，污泥表面的主要細菌由桿狀菌變?yōu)榍驙罹?低濃度下，污泥表面桿菌和球狀菌并存.
3)無論是從COD變化角度還是從PLFA生物標記優(yōu)勢菌種角度看，亞硝氮和硝氮均呈現(xiàn)相似的抑制模式，氨氮與前兩者有顯著差異.亞硝氮和硝氮使厭氧細菌和革蘭氏陽性菌的含量下降，而氨氮僅作用于革蘭氏陰性菌;亞硝氮和硝氮對PLFA香農-威爾多樣性指數(shù)有明顯影響，而氨氮并無明顯作用.
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